組織再生進展的原位監(jiān)測對基礎醫(yī)學研究和臨床轉(zhuǎn)化具有重要意義。盡管在組織工程和再生醫(yī)學領域取得了重大進展，但很少有技術(shù)能夠原位監(jiān)測組織的再生過程。 團隊和上海市第六人民醫(yī)院骨科合作提出了一種集成的第二近紅外（NIR-II, 1000-1700 nm）窗*體成像策略，該策略基于3D打印的摻雜NIR-II鑭系比率型納米探針的生物活性玻璃支架，用以原位監(jiān)測小鼠顱骨修復過程中的早期炎癥反應、血管生成和植入物降解過程。 該研究成果于2022年1月10日以“NIR-II Ratiometric Lanthanide-Dye Hybrid Nanoprobes Doped Bioscaffolds for In Situ Bone Repair Monitoring”為題在線發(fā)表于《納米·快報》(Nano Letters, 2022, 22, 783-791)。

骨修復是*復雜的生物學過程，其中包括細胞增殖、分化和組織形態(tài)變化等過程，大致可分為三個相互重疊的階段：炎癥反應、血管生成和骨重塑。整個骨修復周期通常需要幾個月甚至幾年，同時伴隨著植入物的降解，*終實現(xiàn)新生骨的正常形態(tài)和生物功能性。在臨床上，醫(yī)生需要對骨修復患者的每個階段進行及時診斷和醫(yī)療干預，才能獲得理想的治療效果。然而，超聲、CT、MRI和PET成像等傳統(tǒng)醫(yī)學檢測方法難以實時報告骨修復的整個進程，并且存在放射性等限制。因此，能夠原位監(jiān)測骨修復過程中的炎癥反應、血管生成和植入物降解對于基礎醫(yī)學研究和臨床轉(zhuǎn)化具有重要意義。

熒光成像因其無輻射、高靈敏和高時空分辨等特點在生物醫(yī)學領域中具有極大的應用潛力。利用熒光成像技術(shù)能夠可視化細胞水平和活體水平的生理活動，從而監(jiān)測和了解生物功能和病理過程。然而，當前報道的大多數(shù)熒光探針的發(fā)射波長較短(<900 nm)，限制了其在深組織中的成像質(zhì)量和特異性，并且這些常規(guī)探針通常基于*強度依賴的信號讀出，然而活體組織對光的吸收和散射影像通常會導致熒光信號的波動，*終導致檢測結(jié)果產(chǎn)生較大的誤差。相比之下，比率型熒光傳感器可以通過信號強度的自校準來減少非特異性影響，從而實現(xiàn)可靠的高靈敏檢測效果。

鑒于此，研究團隊提出了一種基于3D打印生物活性玻璃支架的集成活體熒光成像策略：選用具有優(yōu)異生物相容性的生物活性玻璃（BG）作為支架的基質(zhì)材料，以具有近紅外二區(qū)發(fā)光性質(zhì)的稀土納米顆粒（ErNPs）作為發(fā)光核，通過3D打印技術(shù)制備得到ErBG支架，并在支架表面修飾HClO響應的熒光染料（IR808）作為響應基團，*終構(gòu)建得到了近紅外二區(qū)比率熒光生物支架（ErBG@IR808）。將支架植入到小鼠顱骨缺損模型，實現(xiàn)了原位監(jiān)測骨修復過程中的早期炎癥反應、血管生成和植入物降解情況。

圖1. 構(gòu)建近紅外二區(qū)比率熒光生物支架用于原位監(jiān)測骨修復過程示意圖

團隊構(gòu)建了小鼠顱骨缺損模型，并將ErBG@IR808支架植入到缺損部位。研究結(jié)果顯示，由于NIR-II窗口具有深組織穿透和低組織散射的特點，無需任何侵入性操作就可以實時監(jiān)測到支架在活體中的熒光信號。更為重要的是，通過比率熒光成像可以避免組織腫脹所引起的熒光信號波動，從而準確監(jiān)測骨修復過程中的炎癥過程，并且與臨床上血常規(guī)檢測結(jié)果高度一致。

圖2.（a）活體監(jiān)測骨修復過程中炎癥反應示意圖；（b）支架在骨缺損部位的比率熒光成像照片；（c）808 nm和980 nm通道的熒光信號變化；（d）比率熒光信號變化；（e）血常規(guī)結(jié)果

為檢測骨修復過程中血管生長情況，研究團隊通過靜脈注射NIR-II小分子探針LZ1105與ErBG@IR808支架的近紅外二區(qū)熒光信號進行共同定位。結(jié)果表明，在支架植入后的第1天，顱骨缺損部位沒有明顯血管生成；在21天時，可以觀察到大量新生血管沿著支架空隙生長；觀察期至90天時，發(fā)現(xiàn)新生血管繼續(xù)形成并擴散至整個骨缺損區(qū)。更為重要的是，通過活體熒光定量分析計算不同時間點的新生血管數(shù)量，與傳統(tǒng)離體樣本CT分析結(jié)果相一致。此外，支架的NIR-II熒光信號可在體長達12周的時間內(nèi)，原位監(jiān)測支架的降解情況。

圖3.（a）活體監(jiān)測骨修復過程中血管生長示意圖；（b，c）骨缺損部位新生血管的熒光成像照片和統(tǒng)計分析；（d，e）骨缺損部位新生血管的micro-CT成像照片和統(tǒng)計分析；（f）VEGF表達情況。

*，研究團隊對ErBG@IR808支架的活體成骨性能進行了分析。結(jié)果顯示，BG和ErBG@IR808支架上分布有明顯的新生骨組織，并且ErBG@IR808支架可以促進血管生長和新骨形成，加速骨缺損修復。此外，H&E染色結(jié)果顯示，支架在植入后12周內(nèi)對小鼠的心、肝、脾、肺和腎等器官沒有損傷，表明ErBG@IR808支架在長期監(jiān)測骨修復進展中具有良好的活體生物相容性。未來，這種集成的NIR-II熒光成像策略還可以進一步拓展到原位監(jiān)測血管、神經(jīng)等組織工程的進程，以及可植入醫(yī)療器械與宿主的免疫反應。

圖4.（a）離體骨缺損樣本的光學照片和熒光照片；（b，c）Micro-CT照片和新生骨統(tǒng)計分析；（d）新生骨組織的連續(xù)熒光標記照片；（e）Masson染色；（f）對OCN免疫組化染色。

該工作得到了復旦大學化學系、聚合物工程*重點實驗室、上海市分子催化和功能材料重點實驗室、*重點研發(fā)項目、*自然科學基金委員會、上海市科學技術(shù)委員會等機構(gòu)與項目的大力支持。

參考文獻

Peng Pei#, Hongxing Hu#, Ying Chen#, Shangfeng Wang, Jing Chen, Jiang Ming, Yiwei Yang, Caixia Sun, Shichang Zhao*and Fan Zhang*.NIR-II Ratiometric Lanthanide-Dye Hybrid Nanoprobes Doped Bioscaffolds for In Situ Bone Repair Monitoring. Nano Lett., 2022, 2, 783-791.

| 儀器

近紅外二區(qū)小動物活體成像系統(tǒng)NIR-II-ST

NIR-II in vivo imaging system

      近年來，近紅外二區(qū)成像（NIR-II，1000-1700nm）已成為活體成像研究領域內(nèi)的熱點，相對于傳統(tǒng)的可見光（VIS，400-700nm）以及近紅外一區(qū)（NIR-I，700-900nm），NIR-II光具有更好的組織穿透性和更高的空間分辨率。文中利用近紅外二區(qū)小動物活體成像系統(tǒng)

       NIR-II-ST完成了原位監(jiān)測骨修復過程中的早期炎癥反應、血管生成以及植入物降解的熒光成像實驗。這款小動物活體成像系統(tǒng)性能優(yōu)越，可搭配多款深度制冷的InGaAs近紅外相機，高透的成像鏡頭結(jié)合三維平移臺，可以實現(xiàn)大視野及局部小動物高信噪比成像（2 cm×2 cm-20 cm×20 cm），配備全自動操作平臺，可實現(xiàn)電動對焦，多通道小動物麻醉系統(tǒng)，滿足多只小鼠同時成像，激發(fā)光源可選配多重波長激光器、X射線、近紅外LED等等。開發(fā)的控制及圖像處理軟件可以極大的方便用戶，使操作變得更簡單、圖像處理變的更全面。